创新课题实践报告汇总

编辑:阿文时间:2020-05-22 13:08:06
创新课题实践报告汇总,实际上就是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力,从而达到过量积累鸟氨酸的目的,实际上就是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力。

一。对科研项目的认识

微生物发酵法生产l-鸟氨酸,实际上就是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力,选育出营养缺陷型并带有某些结构类似物抗性标记的突变株,以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用,从而达到过量积累l-鸟氨酸的目的。

课外科研创新实践总结

一。对科研项目的认识

微生物发酵法生产l-鸟氨酸,实际上就是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力,选育出营养缺陷型并带有某些结构类似物抗性标记的突变株,以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用,从而达到过量积累l-鸟氨酸的目的。通过优化发酵工艺,使l-鸟氨酸的产量达到最大值。

1.1了解鸟氨酸的理化性质和生物功能

鸟氨酸很难结晶,通常是一种糊状物。溶于水,乙醇,微溶于乙醚。它能电离成两性离子和碱性离子,与酸碱反应,与甲醛、茚三酮等反应。

常用作试剂的是其单盐酸盐,l-鸟氨酸单盐酸盐溶于水,不溶于甲醇、乙醇、乙醚。鸟氨酸存在于多种组织和细胞中,具有生物活性,在新陈代谢中起着重要作用。鸟氨酸在医药和食品工业中占有重要地位。

是尿素生成的中间产物,精氨酸、瓜氨酸等多种氨基酸代谢的前提物质,主要参与产尿素的鸟氨酸循环中,对体内集聚的氨具有解毒作用,因而鸟氨酸对人体肝脏细胞具有重大意义。在近代医药行业,l- 鸟氨酸除用于制备保肝、护肝、**肝病、 抗疲劳、抗虚弱等各种复方氨基酸输液外,还常和精氨酸一起用于配制恢复疲劳的发泡饮料。鸟氨酸因其多功能保健功能而受到世界各国的特别关注。

1.2对鸟氨酸生产的理解

鸟氨酸的生产方法有四种:提取法、化学法、微生物法和酶法。其中,提取方法的制备成本高,提取过程繁琐;在化学方法中,由于合成收率低,在有机合成过程中会产生致癌物合手性分子,分离难度大;酶法是精氨酸在精氨酸酶的作用下,生成l-鸟氨酸,此法产品纯度高,但**昂贵,精氨酸及精氨酸酶均不易获得,限于实验室制备。发酵生产的鸟氨酸均为l型,产品以盐酸鸟氨酸的形式存在。

该方法操作简便,只要选择合适的菌株,就能获得较高的产量,适合工业化生产。

1.3了解l-鸟氨酸生产菌株

目前,发酵生产l-鸟氨酸的起始菌株主要是谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷突变株;乳酸短杆菌、川崎短杆菌和柠檬酸关节杆菌精氨酸缺陷突变株;枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和漆树瓜氨酸缺乏突变株;碳氢化合物增溶剂棒状杆菌和石蜡节杆菌精氨酸缺乏突变株;白纹链霉菌瓜氨酸和硫胺素缺陷突变株。但是,用的最多的还是谷氨酸棒杆菌营养缺陷型菌株。l- 鸟氨酸的生产菌种多是通过菌种选育得到,选择合适的出发菌株,利用紫外线和亚硝基胍等诱变方法,筛选出l-鸟氨酸的高产菌种。

生产菌大都是精氨酸或瓜氨酸的营养缺陷型的棒杆菌及短杆菌(因为鸟氨酸属于胞内氨基酸,菌体内鸟氨酸进一步合成精氨酸,要使其积累鸟氨酸,可以阻止鸟氨酸的下行合成途径,只要通过筛选瓜氨酸和精氨酸缺陷型菌株就能实现)。

1.4生产l-鸟氨酸的研究

1957年, udaka利用谷氨酸棒杆菌的瓜氨酸缺陷型突变株来生产鸟氨酸, 在含限量要求物质精氨酸的培养基中培养, 成功地蓄积了大量的鸟氨酸, 开创了应用营养突变株发酵生产氨基酸的方法。此后, okumura和shibuya等人在这方面也做了大量的工作, 总结出了具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸盐抗性的谷氨酸棒杆菌以及具有精氨酸缺陷、 瓜氨酸缺陷和霉酚酸抗性等标记的柠檬酸节杆菌突变株在发酵法生产鸟氨酸工业上的应用。他们的研究成果几乎都是以专利文献的形式发表的,但在中国还没有人做过这方面的研究。

鸟氨酸的生产主要在日本。主要有味吉苏、田道药业、协和发酵三家厂家。目前,仅日本的鸟氨酸市场规模就达15亿日元,其需求也在不断增加。但鸟氨酸的生产却极为不易,日本在80年代末也还在采用以精氨酸为原料,经碱法水解或利用精氨酸酶水解得到鸟氨酸。

1988年, katsumata ryoichi, yokoi haruhiko 等将编码n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酸- -半醛脱氢酶等酶基因片段从质粒 pe arg 1 中切割下来, 再将其连接到 pe arg 2 质粒中,导入这种重组质粒的谷氨酸棒杆菌产鸟氨酸可以达到21 g/ dl。

2课题研究目的与意义

2.1目的

鸟氨酸生产菌株对l-鸟氨酸产量的大量积累主要包括以下两个方面:一方面,从微生物代谢机理角度考虑,解除代谢机制中的反馈抑制与反馈阻遏,可使制备过程向着鸟氨酸高产的方向进行;另一方面,从鸟氨酸积累的发酵环境考虑,优化突变菌株发酵时的培养条件,如培养基组分及浓度,碳氮源,无机盐及生长因子等;发酵条件如温度、ph值、溶氧水平和摇床发酵条件的优化可以提高l-鸟氨酸的产量。因此,本研究从这两个方面出发,寻找最适合的发酵菌株,优化发酵工艺。

2.2意义

近年来,由于氨基酸在医药、保健品、日用化工等方面有极其广泛的用途,尤其随着抗癌药物制剂、氨基酸营养制剂的飞速发展,对原料氨基酸的需求量日益增长,市场需求量不断增加。鉴于l-鸟氨酸的国内外市场的供需状况以及发展民族氨基酸产业的需求,微生物发酵法生产鸟氨酸的研究,具有重大的经济意义和理论意义。

3本课题研究情况

3.1生产菌株的选育

利用物理和化学因素诱发突变,是提高细菌产量和性能的主要手段。选择合适的诱变条件,对菌液进行诱变,吸取0.1ml菌液包被到抗性筛选培养基中。

32℃下培养数天后将平板上的单菌落转入抗性筛选斜面培养基中继续培养,然后再分别摇瓶培养,测定鸟氨酸产量,选取鸟氨酸产量较高的突变株。

3.2摇瓶发酵工艺优化

发酵条件包括发酵培养基的优化、培养温度、ph值、通风等。这些因素对微生物的生理和形态也有很大的影响,也直接影响发酵产物的生产。

3.2.1发酵培养基主要成分的单因素实验

选择不同的碳源和氮源,选择最佳的碳源和氮源,然后进行正交优化实验,确定最佳组合。

3.2.2发酵培养基的ph值选择

通过设定不同的发酵初始ph梯度和caco3浓度梯度,对发酵液中谷氨酸棒杆菌含量的影响,从而**对l-鸟氨酸含量提高的影响,得出最佳caco3浓度和ph值的最佳组合。

3.2.3发酵温度的选择

温度对发酵产酸的影响是多方面的,从酶反应动力学考虑,温度越高,反应速度越快,生长速度快,产物生成提前,但是,酶受热容易失活,温度越高,失活越快,菌体也越容易衰老。

3.2.4发酵通风的选择

鸟氨酸发酵属于好气性发酵,溶解氧对菌体生长和发酵产酸都有密切关系,所以发酵过程应保证通风,以满足菌体生长和产酸的需要。在一定温度下,溶解氧是液体负荷和振动筛转速的函数。当振动筛转速一定时,液体装载量将直接影响培养基的条件;同样,如果液体量固定,摇瓶转速将成为影响培养液条件的主要因素。

3.2.5生物素在发酵培养基中的作用

一种生物素生长因子。在微生物发酵过程中,生物素的含量对发酵产物的产量有很大的影响。建立菌液中生物素含量的检测方法,进行生物素添加实验,考察生物素对鸟氨酸分泌的影响。

4我的任务

参与菌株的筛选和纯化,检测菌株的活性

活化培养基、种子培养基和发酵培养基的制备

生物素含量的测定

生物素鉴定培养基的制备:生物素鉴定培养基:葡萄糖145g/l,硫酸镁0

65g/l,磷酸二钾#url#,氯化钾#url#,硫酸亚铁#url#,硫酸锰#url#

002g/l,ph7.0121℃灭菌15min。

生物素标准液的配制:精确称取一定量的标准生物素样品,加少量乙醇于50℃下溶解,加水稀释、定容,得到#url#的生物素标准溶液,在121℃灭菌15min,4℃保藏,备用。

生物素标准曲线的绘制:取500ml无菌三角瓶,分装18ml鉴定用培养基、不同量的生物素标准溶液及0.4ml菌液。

在32℃、200r/min的摇瓶中培养12h,摇瓶后摇匀,用可见分光光度计测定650nm处的吸光度(a)。以生物素含量为横坐标,以样品吸光度与空白吸光度之差为纵坐标,绘制生物素标准曲线。从样品吸光度中减去空白吸光度得到测量吸光度,并根据回归函数计算x值。

x×20×稀释倍数=生物素含量(g/l)。

l-鸟氨酸标准曲线图:

配制6mh**o4;冰乙酸与6mh**o4以1:3混匀;25 mg/l茚三酮溶液制备:1

25克茚三酮和50毫升混合酸在70℃下溶解,然后保存在棕色瓶中; l-鸟氨酸单盐标准溶液的配制(2mol/l); 1ml l-鸟氨酸标准液与1ml茚三酮在100℃保温一个小时,取出立即降温后加入3ml冰乙酸,在512nm处测吸光值,配制不同浓度梯度的l-鸟氨酸单盐标准溶液。以不同浓度的l-鸟氨酸标准溶液为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制l-鸟氨酸标准曲线。

样品中鸟氨酸的测定

将发酵后离心得到的菌液测od512。

发酵液中生物素含量的测定

将制备的发酵液离心测定od650。

生物素对鸟氨酸发酵的影响

取250ml无菌三角瓶15个,以发酵液总体积为28ml,按种子液为2ml,生物素(#url#)加入量分别为0、0.1、0.

2、 0.3、0.4、0。

5、 0.6、0.7、0。

8、 0.9、1.0、1。

1、 1.2、1.3、1。

四。1.5条。无菌水和生物素的总体积为2ml,按28ml的总体积加入发酵液。发酵初期,32℃,200r/min;发酵中期为34℃,220r/min;发酵后期温度为34℃,250r/min。

每4小时取一个样本,离心,然后到上清液中测量od512值。